Архаичные гены костных ганоидов разнообразнее, чем у более молодых групп позвоночных

Рис. 1. Современная панцирная щука Lepisosteus oculatus. Фото с сайта commons.wikimedia.org

Панцирная щука  — настоящее живое ископаемое, представитель древней эволюционной ветви Holostei (костные ганоиды). Недавно осуществленное прочтение ее полного генома открыло много интересных фактов, касающихся генетической эволюции древних рыб. Например, некоторые группы генов (гены светочувствительных белков, гены белков, участвующих в образовании костей и других твердых тканей) оказались у панцирной щуки более многочисленными и разнообразными, чем у более эволюционно молодых представителей позвоночных, включая, с одной стороны, костистых рыб, а с другой — млекопитающих. Получается, что широкий набор генов, сложившийся у примитивных рыб, в ходе специализации новых эволюционных ветвей в основном уменьшался, причем разные ветви теряли разные гены. Такой эволюционный сценарий — вполне реальный, хотя и не всеобщий.

Гены и рыбы

Исследование полных геномов — очень эффективный (хотя и имеющий свои ограничения) способ изучения макроэволюции. Число геномов животных, которые удалось полностью прочитать, сейчас постоянно растет (см. Полностью прочитанных геномов животных уже больше двухсот, «Элементы», 30.12.2015). Занимающаяся ими новая наука — сравнительная геномика — во многом сродни такой заслуженной биологической дисциплине, как сравнительная анатомия, только вот объектами, в структуру которых исследователи вникают, тут служат не многоклеточные организмы, а комплексы генов.

Анализ полных геномов помогает не только разобраться в работе сложнейших молекулярно-биологических механизмов, но и лучше узнать историю их обладателей. Дело в том, что любой современный геном заключает в себе своего рода «генетическую летопись» — множество наслаивающихся друг на друга следов очень разнообразных эволюционных событий, самые древние из которых произошли больше трех миллиардов лет назад, а самые новые — буквально только что. Конечно, «генетическая летопись» не абсолютна. Следы многих событий успевают стереться из нее начисто, и тут уже ничего не сделаешь: «Полностью утраченная информация, не сохранившаяся ни в одном экземпляре, восстановлена быть не может» (А. А. Ляпунов, 1980. О соотношении понятий материя, энергия и информация). С другой стороны, бывают и такие эволюционные новшества, которые на анатомию тела никак прямо не влияют, а вот в геноме запечатлеваются очень четко — так, что «прочитать» их следы можно даже спустя сотни миллионов лет. Ярким примером такого новшества служит полногеномная дупликация (whole genome duplication, WGD), практически несомненно случившаяся в начале эволюции позвоночных и некоторых других групп животных (см. У мечехвостов обнаружены свидетельства полногеномной дупликации, «Элементы», 27.11.2015). Полногеномная дупликация — это удвоение всего генома целиком. Такие события действительно происходили, причем не раз.

История генома позвоночных достаточно сложна. Насколько нам сейчас известно, полногеномных дупликаций в ней было как минимум три. Первые два эпизода, или, как часто говорят, два «раунда» полногеномной дупликации произошли в самом начале эволюционной ветви позвоночных, охватив в результате подавляющее большинство из них. Эти ранние эпизоды обозначают сокращением VGD (англ. vertebrate genome duplication, «геномная дупликация позвоночных»); первая дупликация называется VGD1, вторая, соответственно, VGD2. У всех современных челюстноротых, то есть рыб и их потомков, эти дупликации безусловно есть.

С третьей полногеномной дупликацией дело обстоит иначе. Ее следы обнаруживаются только у рыб, причем далеко не у всех. Очевидно, эта дупликация произошла в одной-единственной эволюционной ветви, которая называется костистые рыбы (Teleostei). В современных статьях ее называют TGD (англ. teleost genome duplication, «геномная дупликация костистых»). Ни у каких других рыб, кроме костистых, этой дупликации нет. Наземные позвоночные произошли от кистеперых рыб, которые костистым не родственны, поэтому и у них тоже этой дупликации нет.

Отсюда неожиданно вытекает одна чисто практическая проблема. Дело в том, что костистые рыбы — это огромная, эволюционно очень успешная группа. На самом деле к ним относится попросту подавляющее большинство современных рыб, включая и тех, которые стали широко распространенными лабораторными объектами. Эти объекты — например, данио-рерио и японская медака — нередко используются для решения биомедицинских задач, связанных с человеком. Проблема же состоит именно в том, что данио и медака — не просто рыбы, а костистые рыбы. У них в геноме есть дупликация TGD, а у человека-то ее нет. Это достаточно серьезно ограничивает возможность переноса результатов, полученных на любых костистых рыбах, на человека (как и на других наземных позвоночных).

Надо сказать, что костистые рыбы — группа по меркам общей эволюционной истории относительно молодая. В палеонтологической летописи они появляются «всего лишь» около 200 миллионов лет назад, в конце триасового периода, то есть примерно тогда же, когда и млекопитающие. В этом месте любой эволюционный биолог скажет, что было бы очень интересно найти или предков, или близких родственников костистых рыб, сходных с ними во всем, кроме уникальных признаков группы Teleostei. Такие предки или родственники будут ближе к «корню» рыбьего эволюционного древа, и их изучение может много дать как для сравнений с наземными позвоночными, линия которых берет начало от того же «корня», так и для понимания хода эволюции рыб в целом.

К счастью, ближайшие соседи костистых рыб по эволюционному древу хорошо известны. Это так называемые костные ганоиды (Holostei), гораздо более древняя группа, появившаяся еще в палеозое и остававшаяся многочисленной весь мезозой. Сейчас от нее осталось всего три рода — ильная рыба, или амия (Amia), панцирная щука (Lepisosteus) и аллигаторова щука (Atractosteus). Все эти рыбы живут в пресных водоемах Северной Америки, и все они заслуженно считаются живыми ископаемыми. Например, возраст рода Lepisosteus — никак не меньше 80 миллионов лет (см. E. O. Wiley, H. P. Schultze, 1984. Family Lepisosteida (gars) as living fossils). Это означает, что во времена, когда динозавры еще вовсю процветали, в реках и озерах Земли уже плавали панцирные щуки, примерно такие же, как сейчас.

Современная панцирная щука всем своим обликом напоминает о древних временах (рис. 1). Это довольно большая (размер некоторых видов достигает двух метров) рыба, покрытая крупными и толстыми ромбовидными чешуями. Такая чешуя называется ганоидной, и у костистых рыб ее нет. Это очень архаичный признак. Плавательный пузырь у панцирной щуки активно используется как орган воздушного дыхания — тоже древняя особенность, которая в эволюции костистых рыб постепенно исчезает. И наконец, сам внешний вид чешуйчатого хищника с длинным телом, вытянутой мордой и пастью, полной острых зубов, придает панцирной щуке поверхностное сходство с неким загадочным ящером. Ее близкий родственник, аллигаторова щука, именно поэтому получил такое название.

Современные панцирные щуки живут только в Северной Америке, от Великих озер до Мексики и Флориды. Но их ископаемые остатки обнаружены и в Европе, и в Африке, и в Индии. Похоже, что раньше ареал рода Lepisosteus охватывал большинство континентов, и только в последние 20 миллионов лет он — вероятно, под давлением более эволюционно молодых костистых рыб — сократился до Северной Америки. Это типичный пример биогеографического явления, которое называется оттесненным реликтом (см. К. Ю. Еськов. История Земли и жизни на ней). В общем, панцирная щука — по всем статьям интересное животное для того, кто хочет узнать что-то новое про эволюцию древних позвоночных.

Гены и деревья

И вот теперь полный геном панцирной щуки прочитан. Недавно вышедшая статья о нем подписана большим международным коллективом исследователей, среди которых такие звезды, как Нил Шубин (Neil Shubin) и Питер Холланд (Peter Holland). Что же мы в этом геноме видим?

Начнем с формальных параметров. Геном панцирной щуки — по меркам позвоночных животных довольно маленький. Его размер, определенный биохимическими методами, составляет 1,39 пикограмма (1,39 триллионных грамма, 1,39·10–12 г); см. T. R. Gregory, 2016. Animal Genome Size Database. Это примерно вдвое меньше, чем, например, у акулы или у лягушки (подробнее о размере генома см. Геномы хвостатых амфибий с самого начала были большими, «Элементы», 24.06.2015). Гораздо сложнее узнать число генов. У животных оно очень слабо связано с размером генома, и точно определить его можно, только полностью этот геном прочитав. У панцирной щуки исследователи насчитали 21 443 белок-кодирующих гена (как понятно из термина, речь идет о генах, кодирующих белки; к этой категории относится подавляющее большинство генов, хотя и не все). Для сравнения, у человека число белок-кодирующих генов, посчитанное примерно таким же способом, составляет 20 296, а у костистой рыбы данио-рерио — 25 642. Эти числа могут не быть окончательными, но качественную картину они практически наверняка отражают верно. У панцирной щуки несколько больше генов, чем у человека, и несколько меньше, чем у типичной костистой рыбы, в роли которой как раз и выступает данио. Примерно 20% генома панцирной щуки состоит не из генов, а из повторяющихся элементов, не кодирующих ничего. Эта цифра — тоже достаточно рядовая, процент повторяющихся элементов в геномах животных бывает и больше.

Итак, что же нового «анатомия» генома панцирной щуки открыла биологам?

Прежде всего, любой прочитанный полный геном позволяет на новом уровне провести исследование, указывающее место обладателя этого генома на эволюционном древе (рис. 2). Теперь можно уверенно сказать, что место панцирных щук — рядом с ильной рыбой (амией), вместе с которой она образует эволюционную ветвь костных ганоидов (Holostei), и эта ветвь — сестринская по отношению к ветви костистых (Teleostei). Как ни странно, этот результат далеко не тривиален. Дело тут вот в чем. В зоологии еще с XIX века было широко распространено мнение, что Holostei — вовсе не эволюционная ветвь (клада), а эволюционный уровень (града). С этой точки зрения древний и мощный ствол лучеперых рыб (Actinopterygii) представал как бы последовательно проходящим сквозь три этажа: хрящевые ганоиды (Chondrostei) — костные ганоиды (Holostei) — костистые рыбы (Teleostei). Такая «градистическая» схема эволюции была по-своему красивой и четкой. Но увы, на данный момент похоже, что столкновения с фактами она не выдерживает. Представление о том, что Holostei — не ветвь, а уровень, подтвердилось бы, если бы амия оказалась генетически ближе к костистым рыбам, чем панцирная щука (или наоборот). Тогда современных Holostei никак нельзя было бы объединить в ветвь, и оставалось бы только считать их уровнем-градой. На самом деле, судя по новейшим данным, амия и панцирная щука как раз прекрасно объединяются в эволюционную веточку, отдельную от костистых, а значит, представление о «градах» тут пока что лишнее.

Архаичные гены костных ганоидов разнообразнее, чем у более молодых групп позвоночных

Рис. 2. Место панцирной щуки (spotted gar) на эволюционном древе позвоночных. Вверху (a) — схематичное древо, на котором обозначены полногеномные дупликации (VGD1, VGD2, TGD). Внизу (b) — молекулярное древо, построенное на основании сравнения последовательностей 243 белков. Цифры обозначают уровни поддержки узлов древа, длина ветвей пропорциональна числу аминокислотных замен. Иллюстрация из обсуждаемой статьи в Nature genetics

Правда, из тех же самых сравнений полных геномов следует, что эволюция ветви Holostei была гораздо более медленной, чем эволюция Teleostei. Но как раз это прекрасно согласуется с данными классической зоологии: ведь и панцирная щука, и амия почти не изменились по сравнению со своими предками, жившими 80 миллионов лет назад. А вот резкое ускорение эволюции у Teleostei вполне можно связать с уникальной для этой ветви дополнительной полногеномной дупликацией — той самой TGD.

Интересно, что не только последовательности большинства генов, но и способы их совместной «упаковки» в хромосомы у панцирной щуки оказались очень консервативными. Панцирная щука имеет 29 пар хромосом, то есть — иными словами — по 58 хромосом во всех клетках, кроме половых (2n = 58). Анализ полных геномов показал, что у таких далеких от панцирной щуки существ, как человек и курица, очень многие участки хромосом сохраняют те же гены, расположенные в том же порядке. Чтобы «превратить» хромосомный набор панцирной щуки в хромосомный набор курицы, требуется всего-навсего 17 крупных генетических событий (хромосомных разрывов, слияний или транслокаций). У костистых рыб структура хромосом гораздо менее устойчива, причем это связано не только с их дополнительной полногеномной дупликацией, но и с волной хромосомных перестроек, которая по какой-то причине охватила геном предка костистых рыб еще накануне этого события.

С точки зрения крупномасштабной эволюции геномов особенно интересны такие гены, которые четко объединяются в семейства (группы генов, происходящих от одного гена-«предка»), а в идеале и в кластеры (группы генов, компактно расположенных друг за другом на хромосоме). Ярким примером таких генов служат Hox-гены, играющие важную роль в развитии многоклеточных животных и поэтому хорошо изученные (см., например: Укорочение тела тихоходок связано с потерей Hox-генов, «Элементы», 04.03.2016). У подавляющего большинства животных Hox-гены образуют единственный кластер; генов в нем обычно примерно десяток, иногда чуть больше, иногда и меньше. Но у позвоночных, как мы знаем, в древности произошло удвоение всего генома, причем дважды. Поэтому Hox-кластеров у них в самом типичном случае четыре, как, например, у человека (Hox-генов у него 39). А вот у костистых рыб геном удвоился в третий раз, поэтому Hox-кластеров у них семь или восемь, хотя Hox-генов обычно всего 45–49; последнее означает, что уже после нового удвоения генома часть Hox-генов за ненадобностью исчезла (B. Guo et al., 2011. Duplicated gene evolution following whole-genome duplication in teleost fish).

Что же мы видим у панцирной щуки? У нее — как и следовало ожидать — всего четыре Hox-кластера, содержащих 43 Hox-гена. Это довольно большое число, означающее, что набор Hox-генов у панцирной щуки очень полный. Такая полнота сама по себе архаична; действительно, во многих ветвях, которые эволюционировали быстрее, чем Holostei, те или иные Hox-гены исчезли. Например, ген Hoxd14 был независимо бесследно потерян и у костистых рыб, и у млекопитающих. В функциональном виде он есть у осетровых рыб, которые относятся к еще более древней, чем Holostei, группе Chondrostei (хрящевые ганоиды). А у панцирной щуки этот ген сохранился, но только в виде нефункционирующего псевдогена. Наличие таких «молекулярных ископаемых» — свидетельство медленной эволюции и одновременно шанс узнать что-то новое о том, как эволюция, собственно, шла.

Еще один интересный фрагмент информации, извлеченный из генома панцирной щуки, относится к эволюции восприятия света. Известно, что у всех позвоночных промежуточный мозг образует светочувствительный вырост — так называемый «третий глаз», или теменной глаз, или эпифиз, или пинеальный орган (всё это одно и то же). У современных животных теменной глаз перекрыт кожей, так что снаружи его не видно, но некоторую чувствительность к свету он всё равно может сохранять. Это — вспомогательный орган зрения, служащий в основном для того, чтобы регистрировать суточные изменения освещенности, управляя соответствующими биоритмами. Для молекулярных биологов и генетиков особенно интересен тот факт, что пинеальный орган имеет собственные светочувствительные белки, отличающиеся от светочувствительных белков обычных парных глаз. У наземных позвоночных таким белком служит пинопсин, а у костистых рыб — неродственный ему экзородопсин (см., например: H. Mano, Y. Fucada, 2007. A median third eye: pineal gland retraces evolution of vertebrate photoreceptive organs). А вот у панцирной щуки, как выяснилось, есть одновременно гены и пинопсина, и экзородопсина — то есть специфических светочувствительных белков пинеального органа у нее сразу два. Получается, что это архаичное состояние. Раньше биологи думали, что у общего предка рыб и наземных позвоночных единственным «теменным» светочувствительным белком был пинопсин, в ветви костистых он был потерян, а взамен него появился экзородопсин. Теперь сценарий выглядит совсем иначе: у общего предка рыб и наземных позвоночных было одновременно два белка с этой функцией, но наземные позвоночные отказались от одного из них, а костистые рыбы — от другого. Это отличный примерно того, как сравнение двух хорошо известных групп животных с третьей, малоизученной, помогает прояснить эволюционный путь и тех и других (рис. 3).

Архаичные гены костных ганоидов разнообразнее, чем у более молодых групп позвоночных

Рис. 3. Схема сравнения генов костистых рыб, человека и панцирной щуки. Сравнивая их попарно, можно обнаружить общность, которая при прямом сравнении костистых рыб с человеком оставалась скрытой. Здесь это относится к нуклеотидным последовательностям отдельных генов, но и при сравнении целых групп генов действует похожий принцип. В качестве представителя людей и здесь, и на предыдущей иллюстрации изображен Сусуму Оно (Susumu Ohno), великий японский генетик, открывший полногеномную дупликацию у позвоночных. Иллюстрация из обсуждаемой статьи в Nature genetics

Гены и ткани

Сравнительная геномика иногда помогает разбираться и в таких проблемах, которые всегда (по крайней мере, на протяжении пары сотен лет) безоговорочно принадлежали наукам об организме — например, той же сравнительной анатомии. Конечно, заменить собой науки об организме геномика не может. Но добавить новые данные, которые позволят увидеть давно знакомый сюжет с неожиданных сторон, — может вполне. Именно так обстоит дело с эволюцией твердых скелетных тканей позвоночных животных.

Определимся с понятиями. Твердые скелетные ткани — это кость, дентин, эмаль и всевозможные более редкие дентиноподобные либо эмалеподобные субстанции (например, ганоин, который входит в состав столь характерной для панцирной щуки ганоидной чешуи). Все эти ткани минерализованы, причем их минеральную основу образуют микроскопические кристаллики фосфата кальция (Ca3(PO4)2). Фосфатные твердые ткани — одна из самых уникальных особенностей, выделяющих позвоночных среди всех современных животных. Неудивительно, что история этих тканей очень важна для понимания того, как эволюция позвоночных вообще шла (см., например: У хрящевых рыб есть белки, нужные для формирования костей, «Элементы», 23.09.2013). Например, были ли первые настоящие позвоночные панцирными, чешуйчатыми или вовсе мягкотелыми? И в любом случае, что появилось раньше — чешуя или панцирь? Полное представление о начале эволюции наших предков невозможно без ответов на эти, казалось бы, совсем простые вопросы.

Теперь представим, что мы смотрим на эволюционный процесс сквозь некий воображаемый универсальный прибор, отдаленно напоминающий телескоп или микроскоп. Мысленно переключим оптику этого прибора с морфо-физиологического уровня на молекулярный. Тогда мы будем видеть не целые организмы, а гены и белки. Например, для всех минерализованных тканей позвоночных очень важна группа специфических белков, которые кратко называются кальций-связывающими белками (их более длинное и точное название — secretory calcium-binding phosphoproteins, Scpp). Эти белки разнообразны и многочисленны: например, в геноме человека найдено целых 23 гена кальций-связывающих белков скелетных тканей. У современной кистеперой рыбы латимерии таких генов 14. У данио-рерио — 15. Обратившись к эволюционному древу, мы тут же увидим, что человек и латимерия относятся к единому эволюционному стволу мясистолопастных (Sarcopterygii), в который костистые рыбы, в том числе и данио, не входят. При этом из всех генов кальций-связывающих скелетных белков общими у мясистолопастных и костистых являются только два! Может быть, это значит, что у их общего предка твердые ткани были плохо развиты?

Совсем нет. Именно тут нам поможет панцирная щука — древняя и по многим признакам примитивная рыба, не относящаяся ни к мясистолопастным, ни к костистым. В геноме панцирной щуки генов кальций-связывающих скелетных белков найдено аж 35. Это почти в полтора раза больше, чем у млекопитающих, и более чем вдвое больше, чем у латимерии и данио. Те два гена, которые являются общими у костистых рыб и у мясистолопастных, здесь тоже присутствуют. Но, кроме того, среди генов кальций-связывающих белков панцирной щуки есть пять генов, которые раньше считались уникальными для костистых рыб, и шесть генов, которые раньше считались уникальными для мясистолопастных! Получается, что у «примитивных» рыб, представителем которых панцирную щуку в данном случае вполне можно считать, набор этих генов был богат и универсален. А вот дальше началась специализация, которая привела к потере части генов — причем в разных ветвях терялось разное. Примерно такой же сценарий мы только что видели в эволюции светочувствительных белков теменного глаза; но здесь он еще более выразителен.

Интересно, что еще 18 генов кальций-связывающих белков, обнаруженных у панцирной щуки, пока вообще не найдены ни у костистых рыб, ни у мясистолопастных. Эти гены (и соответствующие им белки) или исчезли в эволюции большинства рыб очень рано, или, наоборот, возникли только в ветви Holostei. Решение этого вопроса, надо думать, поможет понять, как чаще идет молекулярная эволюция: путем постепенного добавления новых генов или путем относительно быстрого образования большого генного «пула», из которого потом каждая ветвь выбирает гены, подходящие именно для нее. Данные по панцирной щуке пока скорее говорят в пользу второго механизма, но еще неизвестно, насколько широко он распространен.

Источник: elementy.ru

158 КОММЕНТАРИИ

  1. I just want to say I am beginner to blogging and site-building and truly savored you’re blog. Almost certainly I’m planning to bookmark your website . You definitely come with amazing articles and reviews. Regards for revealing your website.

  2. Every code I try either leaves a massive gap at the top of the page, or at the bottom of the page. Its definitely that code causing it.. I’ve tried so many codes trying to hide the blogs & extended network, but they all leave a white gap either at the top or at the bottom.. Anyone got one that doesnt cause the white gap? Or how to remove the white gap?.

  3. I like the valuable info you provide in your articles. I will bookmark your blog and check again here frequently. I’m quite certain I’ll learn a lot of new stuff right here! Good luck for the next!

  4. Hiya, I’m really glad I have found this info. Nowadays bloggers publish just about gossips and web and this is really irritating. A good site with interesting content, that’s what I need. Thank you for keeping this website, I’ll be visiting it. Do you do newsletters? Cant find it.

  5. Hi there. I was just wondering why its such a big thing these days to have a ridiculous amount of ram in a computer? People tell me that the more Ram you have in your computer the faster your computer will be. I always thought that it was the processor that controls the speed of a computer and not the Ram.. . I had 512MB of Ram in my laptop and I have now changed it to 2Gigs of Ram and I’ve seen no difference in performance what so ever. . Could somebody please explain to me what does Ram does exactly?. Thanks in advance.

  6. I am thinking of buying a joomla template from template monster and importing it into joomla.. . How hard are they to import? Is it plug and play easy? Or will I need to configure plugins etc.. . Thanks..

  7. I simply want to tell you that I’m very new to blogging and truly liked your web blog. Likely I’m going to bookmark your blog post . You amazingly have perfect articles and reviews. With thanks for sharing your website page.

  8. Excellent read, I just passed this onto a friend who was doing a little research on that. And he just bought me lunch because I found it for him smile Thus let me rephrase that: Thank you for lunch!

  9. There is apparently a lot to realize about this. I think you made various good points in features also.

  10. Definitely believe that which you stated. Your favorite justification appeared to be on the internet the simplest thing to be aware of. I say to you, I certainly get annoyed while people consider worries that they just do not know about. You managed to hit the nail upon the top as well as defined out the whole thing without having side-effects , people can take a signal. Will probably be back to get more. Thanks

  11. Can I just say what a relief to seek out someone who actually knows what theyre speaking about on the internet. You positively know tips on how to bring a difficulty to mild and make it important. Extra folks need to learn this and understand this facet of the story. I cant imagine youre not more common because you undoubtedly have the gift.

  12. Whats up very cool web site!! Guy .. Beautiful .. Superb .. I will bookmark your site and take the feeds additionally¡KI’m happy to search out numerous useful information right here within the put up, we need develop extra techniques in this regard, thanks for sharing. . . . . .

  13. It¡¦s really a nice and useful piece of information. I am glad that you shared this helpful info with us. Please stay us up to date like this. Thanks for sharing.

  14. It¡¦s actually a great and useful piece of info. I am happy that you just shared this helpful information with us. Please stay us up to date like this. Thank you for sharing.

  15. How can I fix Firefox browser because it opens everytime not only my homepage but 2 more pages from NoScript and Firefox update? I tried cleaning cache and everything I found. Still no ideea! Thanks!.

  16. This is very interesting, You’re a very skilled blogger. I’ve joined your rss feed and look forward to seeking more of your magnificent post. Also, I’ve shared your website in my social networks!

  17. I follow all the installation instructions, after downloading, but Mozilla Firefox blocks the installation..

  18. Without asking them to remove it, is there a method i can remove my own blog comments on somebody else’s blog? Please help(:.

  19. Wonderful goods from you, man. I have understand your stuff previous to and you are just too wonderful. I actually like what you have acquired here, really like what you’re saying and the way in which you say it. You make it enjoyable and you still care for to keep it wise. I can’t wait to read much more from you. This is actually a wonderful site.

  20. I loved as much as you’ll receive carried out right here. The sketch is attractive, your authored subject matter stylish. nonetheless, you command get got an shakiness over that you wish be delivering the following. unwell unquestionably come more formerly again since exactly the same nearly a lot often inside case you shield this increase.

  21. A person claimed that you had to purchase a domain name, or your blog sites weren’t seen by everyone, is that real? Do you know what a domain is? IF not do not address please.

  22. I have actually seen a great deal of blogs in blogspot. What objective do they offer? Is it possible to earn money via blogs. If yes exactly how?.

  23. hello!,I like your writing so much! proportion we keep
    in touch more about your post on AOL? I need an expert in this house to resolve my problem.
    May be that’s you! Taking a look forward to peer you.

  24. Write more, thats all I have to say. Literally, it seems as though you relied on the video to make your point.
    You definitely know what youre talking about, why waste your intelligence
    on just posting videos to your site when you could be giving us something informative to read?

  25. Hello, this weekend is nice designed for me, as this point in time i am reading this wonderful educational piece of writing here at my
    house.

  26. I’m not sure where you’re getting your information, but great topic.
    I needs to spend some time learning much more or understanding more.

    Thanks for excellent info I was looking for this info for my mission.

  27. Hi there, I discovered your website by the use of Google while searching for a related topic,
    your site came up, it looks good. I have bookmarked it in my google
    bookmarks.
    Hello there, simply was aware of your weblog
    via Google, and located that it’s really
    informative. I am gonna watch out for brussels.
    I’ll be grateful in the event you proceed this in future.
    A lot of other folks will be benefited from your writing.
    Cheers!

  28. I know this if off topic but I’m looking into starting my own blog and was wondering what all is needed to get setup?
    I’m assuming having a blog like yours would cost a pretty penny?
    I’m not very internet savvy so I’m not 100% sure.
    Any recommendations or advice would be greatly appreciated.
    Cheers

  29. You actually make it seem so easy with your presentation but I find this matter to be actually something which
    I think I would never understand. It seems too complex and very broad for me.
    I’m looking forward for your next post, I will
    try to get the hang of it!

  30. I enjoy what you guys are up too. This kind of clever work
    and coverage! Keep up the fantastic works guys I’ve incorporated you guys to blogroll.

  31. Wow, marvelous blog layout! How long have you been blogging for?

    you make blogging look easy. The overall look
    of your website is excellent, let alone the content!

  32. What a information of un-ambiguity and preserveness of precious knowledge on the topic of unexpected emotions.

  33. Thank you for another wonderful post. Exactly where else could anybody get that kind of information and facts in such a ideal way of writing? I’ve a presentation next week, and I am on the appear for such details.

  34. Do you blog? Do you blog to promote items you are selling? I am instead brand-new to the blogging globe. I mainly blog to market items that I am marketing and web sites that I am marketing on. How do I obtain website traffic to my blog? Do I essentially just need to include web content? Does my blog obtain gotten in the search? Any advice on blog writing is significantly required. Hey there, yes I mention it on my twitter account as well as also my other web-sites.

  35. Pretty section of content. I simply stumbled upon your web site and in accession capital to say
    that I get actually loved account your weblog posts.
    Any way I will be subscribing to your augment or even I fulfillment you
    get admission to constantly rapidly.

  36. I’ve been exploring for a bit for any high-quality articles or weblog posts on this kind of area .
    Exploring in Yahoo I at last stumbled upon this website. Reading this info So i am satisfied to show
    that I’ve an incredibly just right uncanny feeling I found out exactly what I needed.
    I such a lot without a doubt will make certain to do not fail to remember this site and provides it a
    glance on a constant basis.

  37. Hello i am kavin, its my first time to commenting anywhere, when i read this piece of writing i thought i could also create comment
    due to this good article.

  38. When someone writes an article he/she retains the plan of a user
    in his/her mind that how a user can understand it.
    So that’s why this post is great. Thanks!

  39. After I initially left a comment I seem to have clicked on the -Notify me when new comments are added- checkbox and now whenever a comment is
    added I receive four emails with the exact same comment.
    There has to be a means you are able to remove me from that service?
    Cheers!

  40. Spot on with this write-up, I honestly think this
    web site needs far more attention. I’ll probably be returning to see more, thanks
    for the advice!

  41. Thanks for finally writing about >Архаичные гены костных ганоидов разнообразнее, чем у более молодых групп позвоночных | Компьютерная жизнь: Hi-Tech новости <Loved it!

  42. Hmm is anyone else having problems with the pictures on this blog loading?
    I’m trying to determine if its a problem on my end or if it’s the blog.

    Any feedback would be greatly appreciated.

  43. I’m a teen and also I listened to that you can really earn money for points similar to this. I’m experienced with computers as well as have excellent literature abilities and I’m sure I can compose successful blogs/articles … On a different (kind of) topic, would certainly I be able to sign up with affiliate programs?.

  44. excellent post, very informative. I’m wondering why the other specialists of this sector do not realize this.
    You must proceed your writing. I’m confident, you’ve a huge readers’
    base already!

  45. Everyone loves what you guys are usually up too. This kind of
    clever work and reporting! Keep up the terrific works guys
    I’ve added you guys to our blogroll.

  46. Hello would you mind letting me know which web host you’re utilizing?
    I’ve loaded your blog in 3 completely different internet browsers and I must say this blog loads a lot faster then most.
    Can you recommend a good internet hosting provider at a reasonable price?
    Thanks, I appreciate it!

  47. Usually I don’t read post on blogs, but I would like to say that this
    write-up very compelled me to check out and do so!
    Your writing style has been surprised me. Thank you, quite nice
    post.

  48. The answer to those questions cut right to the core of a debate that always has and always will exist within the gambling community. An underlying theme within the industry is whether or not handicapping is a purely mathematical endeavor or one that involves a certain mysticism and «feel». Consider it the oddsmaker’s version of Nature vs. Nurture.

  49. Hi, i believe that i saw you visited my blog so i got here
    to return the choose?.I’m trying to find issues to improve my website!I suppose its adequate
    to make use of a few of your concepts!!

  50. Thank you for any other wonderful article. Where else could
    anyone get that kind of information in such a perfect manner of writing?
    I’ve a presentation subsequent week, and I am
    at the search for such information.

  51. Somebody essentially assist to make severely articles I might state.
    This is the first time I frequented your web page and so
    far? I amazed with the analysis you made to create
    this particular post amazing. Magnificent activity!

  52. Nice blog here! Additionally your site loads up very fast!

    What host are you using? Can I am getting your associate link
    on your host? I want my website loaded up as fast as yours lol

  53. Hi there i am kavin, its my first time to commenting anywhere, when i read this paragraph i thought i could also create comment due to
    this brilliant article.

  54. It is appropriate time to make some plans for the longer term and it’s time to be happy.
    I’ve learn this put up and if I may I want to recommend you few attention-grabbing things or tips.
    Maybe you could write subsequent articles referring to this article.

    I want to learn more issues about it!

  55. Why viewers still make use of to read news papers when in this technological world all is
    existing on web?

  56. I really love your website.. Excellent colors & theme. Did you
    build this web site yourself? Please reply back as I’m hoping to create my
    very own website and would like to learn where you got this
    from or exactly what the theme is called. Appreciate it!

  57. I’m pretty pleased to uncover this website. I need to to thank you
    for your time for this wonderful read!! I definitely appreciated
    every part of it and I have you saved to fav to see new information in your website.

  58. First off I want to say excellent blog! I had
    a quick question that I’d like to ask if you do not mind.
    I was interested to know how you center yourself and clear
    your mind prior to writing. I’ve had a tough time clearing my mind in getting my ideas out there.

    I do enjoy writing however it just seems like the first 10 to 15 minutes are generally lost simply just trying to figure out how to
    begin. Any suggestions or tips? Kudos!

  59. I am extremely impressed with your writing skills
    and also with the layout on your weblog. Is this a paid theme or did you customize it yourself?
    Either way keep up the nice quality writing, it is rare to see a nice blog like this one today.

  60. Hi there to every one, since I am genuinely keen of reading this
    website’s post to be updated daily. It consists of fastidious
    information.

  61. If some one wants to be updated with latest technologies after that he must be pay a visit this web
    site and be up to date all the time.

  62. wonderful issues altogether, you just won a emblem
    new reader. What may you suggest in regards to your post that
    you simply made some days ago? Any positive?

  63. Its like you read my mind! You appear to grasp so much approximately this,
    like you wrote the ebook in it or something.
    I feel that you can do with a few p.c. to force the message house
    a bit, but other than that, this is magnificent blog. A great read.
    I’ll definitely be back.

  64. I’m a teen and also I listened to that you can really earn money for things such as this. I’m experienced with computer systems and have excellent literature abilities and I make certain I can create effective blogs/articles … On a various (type of) topic, would certainly I have the ability to join affiliate programs?.

  65. hello there and thank you for your info – I’ve definitely picked up something new from right here.

    I did however expertise a few technical points using this web site,
    since I experienced to reload the site lots of times previous to I could get it
    to load properly. I had been wondering if your web hosting is
    OK? Not that I’m complaining, but sluggish loading instances times will sometimes
    affect your placement in google and could damage your quality score if ads and marketing with Adwords.
    Well I’m adding this RSS to my e-mail and could look out for a lot more of your respective fascinating content.

    Make sure you update this again very soon.

  66. Just how does one earn money from blog sites? Exactly how does one start it or set about it? Exists a particular means to do it? Just exactly how does one generate income from blogs in the first place? Where does one get started in this? Do you have to advertise and use your credit card? Are there any specific sort of rules you need to adhere to? Do you have to establish the blog site up yourself or exist ones that help you establish it up? How do you get advertisers on your blog site? Are people limited to the number of blogs online? How commonly do you get paid?. Many thanks for the assistance!.

  67. I’m really impressed with your writing skills as smartly as with the layout in your
    weblog. Is this a paid subject or did you modify it your self?
    Anyway stay up the nice quality writing, it’s uncommon to
    peer a great blog like this one these days..

  68. Write more, thats all I have to say. Literally, it seems as though you relied on the video to make your point.

    You obviously know what youre talking about, why waste your intelligence
    on just posting videos to your site when you could be giving us something informative to read?

  69. This is the perfect website for everyone who hopes to understand this topic.

    You realize a whole lot its almost tough to argue with you (not that I personally will need to…HaHa).
    You definitely put a fresh spin on a topic that’s been written about for decades.
    Excellent stuff, just wonderful!

  70. It is not my first time to pay a visit this web page, i am visiting this website dailly and get nice
    data from here everyday.

  71. Thanks for your marvelous posting! I certainly enjoyed reading it,
    you might be a great author.I will make sure to bookmark your
    blog and will often come back in the future.
    I want to encourage you continue your great job, have
    a nice day!

  72. Hmm it appears like your website ate my first comment (it was super
    long) so I guess I’ll just sum it up what I wrote and say, I’m thoroughly enjoying your blog.
    I too am an aspiring blog writer but I’m still new to the whole
    thing. Do you have any helpful hints for rookie blog writers?

    I’d genuinely appreciate it.

  73. magnificent points altogether, you simply received
    a emblem new reader. What would you suggest in regards to your submit that you simply made some days ago?
    Any certain?

  74. Everyone loves what you guys tend to be up too. This type
    of clever work and exposure! Keep up the terrific works guys I’ve added you guys to
    my own blogroll.

  75. I’m not that much of a online reader to be honest but your blogs
    really nice, keep it up! I’ll go ahead and bookmark
    your site to come back down the road. Many thanks

  76. Definitely imagine that which you stated. Your favorite reason seemed to be at the web the easiest
    thing to keep in mind of. I say to you, I definitely get annoyed even as people think about issues that they just don’t realize about.
    You controlled to hit the nail upon the top as smartly as defined out the entire thing without having side-effects , folks
    could take a signal. Will probably be back to get more.
    Thanks

  77. Excellent beat ! I wish to apprentice whilst you amend your
    website, how could i subscribe for a weblog site?
    The account helped me a acceptable deal. I were a little bit
    acquainted of this your broadcast offered shiny transparent concept

  78. Every weekend i used to go to see this site, as i want enjoyment,
    since this this web page conations truly nice funny material too.

  79. Greetings from Colorado! I’m bored to tears at work so I decided to
    check out your site on my iphone during lunch break.
    I enjoy the knowledge you provide here and can’t wait to take a look when I get home.
    I’m shocked at how quick your blog loaded on my mobile ..
    I’m not even using WIFI, just 3G .. Anyways, fantastic blog!

  80. It’s going to be finish of mine day, but before finish I am reading
    this great article to increase my know-how.

  81. Hey I know this is off topic but I was wondering if you knew of any widgets I could
    add to my blog that automatically tweet my newest twitter updates.
    I’ve been looking for a plug-in like this for quite some time and was hoping maybe you would have some experience with something like this.
    Please let me know if you run into anything. I truly enjoy reading your blog and I
    look forward to your new updates.

  82. Heya this is somewhat of off topic but I was wanting to know if blogs use WYSIWYG editors or if you have to manually
    code with HTML. I’m starting a blog soon but have no coding expertise so I wanted to
    get advice from someone with experience.
    Any help would be enormously appreciated!

  83. Hi, Neat post. There is a problem together with your site in web explorer, might check this?
    IE nonetheless is the marketplace leader and a huge element of
    folks will leave out your excellent writing due to this problem.

  84. Hello there! I know this is kind of off topic but I was wondering which blog platform are
    you using for this website? I’m getting tired of WordPress because I’ve had issues with hackers
    and I’m looking at alternatives for another platform.

    I would be fantastic if you could point me in the direction of a good platform.

  85. Hi there it’s me, I am also visiting this web
    site daily, this site is in fact fastidious and the visitors are truly
    sharing good thoughts.

  86. Good day very nice site!! Man .. Beautiful .. Superb .. I’ll bookmark your website and take the feeds additionally…I’m satisfied to seek out a lot of useful info here in the post, we’d like develop more strategies on this regard, thank you for sharing.

  87. I am extremely impressed along with your writing
    skills as neatly as with the structure in your weblog.
    Is that this a paid subject matter or did you customize it yourself?
    Anyway stay up the nice quality writing, it is rare to look
    a nice weblog like this one today..

  88. Hey! This is my first visit to your blog! We are a group of volunteers and starting a new
    project in a community in the same niche. Your blog provided us useful information to work on. You have done a marvellous job!

  89. There couple of fascinating points in time in this article but I do not determine if these center to heart. There may be some validity but I am going to take hold opinion until I take a look at it further. Good write-up , thanks therefore we want more! Combined with FeedBurner at the same time

  90. Hi! I’ve been following your web site for a long time now and
    finally got the courage to go ahead and give you a shout out from Dallas Tx!

    Just wanted to say keep up the great job!

  91. Wow, amazing blog layout! How long have you been blogging for?
    you made blogging look easy. The overall look of your web site is excellent,
    as well as the content!

  92. Great blog! Do you have any tips for aspiring writers?
    I’m hoping to start my own website soon but I’m a little lost on everything.

    Would you suggest starting with a free platform like
    Wordpress or go for a paid option? There are so many choices out there that I’m completely confused ..
    Any recommendations? Many thanks!

  93. Heya i’m for the first time here. I came across this board and I find
    It really useful & it helped me out much. I hope to give something back and help others like you helped me.

  94. Hi! I just wanted to ask if you ever have any problems with
    hackers? My last blog (wordpress) was hacked and I ended up
    losing a few months of hard work due to no data
    backup. Do you have any solutions to stop hackers?

  95. Thanks , I’ve recently been searching for info about this
    topic for a while and yours is the best I have discovered till now.
    But, what about the conclusion? Are you sure in regards to the source?

  96. It seems there are sites and also blogs dedicated to lots of activities, such television, songs, lives of stars, etc. Yet I actually can not locate web sites and blogs committed to analysis, sadly a second thought when it comes to activities … Any individual know some truly popular as well as wonderful ones? Timeless as well as current literature are both great with me, since I read both … Thanks so much! =o-RRB-.

  97. Exactly how do I start a blog under a pen-name as well as maintain my anonymity. Exactly how do you after that obtain normal visitors?

  98. Heya i’m for the first time here. I found this board and I in finding It truly helpful & it helped me out much.

    I hope to present one thing again and aid others such as you aided me.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ